mRNA entregue por via intradérmica

Jun 08, 2024

Nature Biomedical Engineering volume 7, páginas 887–900 (2023)Cite este artigo

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O sucesso da terapêutica do RNA mensageiro depende em grande parte da disponibilidade de sistemas de entrega que permitam a tradução segura, eficaz e estável do material genético em proteínas funcionais. Aqui mostramos que vesículas extracelulares (EVs) produzidas via nanoporação celular de fibroblastos dérmicos humanos e encapsulando mRNA que codifica o colágeno α1 tipo I de matriz extracelular (COL1A1) induziram a formação de enxertos de proteína de colágeno e reduziram a formação de rugas no colágeno. tecido dérmico esgotado de camundongos com pele fotoenvelhecida. Mostramos também que a entrega intradérmica dos EVs carregados com mRNA através de um conjunto de microagulhas levou à síntese e substituição prolongada e mais uniforme de colágeno na derme dos animais. A administração intradérmica de mRNA de COL1A1 baseado em EV pode constituir uma terapia de reposição protéica eficaz para o tratamento da pele fotoenvelhecida.

Desenvolvimentos recentes em técnicas de modificação de RNA mensageiro aumentaram a eficiência terapêutica da entrega de mRNA e seu potencial para aplicações clínicas de curto prazo, incluindo terapia de reposição de proteínas e vacinação contra o vírus da síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2)1, 2. No entanto, a incapacidade intrínseca e a imunogenicidade potencial dos ARNm exigem que estes sejam encapsulados em veículos de entrega. As modalidades atuais de entrega de mRNA centram-se no uso de transportadores de nanopartículas lipídicas (LNP) para encapsulamento e transporte . No entanto, os LNPs apresentam vários desafios importantes, incluindo citotoxicidade, fraca biodistribuição, falta de especificidade do alvo e imunogenicidade. Esses problemas podem ser causados ​​pela necessidade de PEGilação de superfície (PEG significa poli(etilenoglicol)) de LNPs para melhorar sua meia-vida circulatória e reduzir a depuração inespecífica5,6. Notavelmente, a administração de LNPs em pessoas tem sido associada a anafilaxia, hipersensibilidade e eventos adversos autoimunes7,8. Portanto, a identificação de transportadores de mRNA que possam superar alguns destes desafios associados ao LNP seria útil para o desenvolvimento adicional de terapêutica baseada em mRNA.

As vesículas extracelulares (EVs), incluindo exossomos e microvesículas, desempenham um papel importante no transporte de biomoléculas e ácidos nucleicos, incluindo mRNAs, dentro do corpo humano9,10,11. Como resultado, nos últimos anos, os EVs surgiram como transportadores promissores para terapêutica baseada em ácidos nucleicos devido à sua biocompatibilidade intrínseca, à sua capacidade de atravessar barreiras fisiológicas e à sua baixa imunogenicidade12,13. Ao contrário dos LNPs, os EVs, incluindo os exossomos, são produzidos endogenamente pelas células do corpo e levam a níveis mais baixos de respostas inflamatórias. Além disso, foram desenvolvidas estratégias para produzir grandes quantidades de exossomos de maneira fácil e barata. Relatamos anteriormente um método de nanoporação celular (CNP) no qual poros nanométricos transitórios foram criados na superfície das células fonte para permitir o carregamento em larga escala de mRNAs transcritos completos em EVs secretados. Aqui, usando um modelo de fotoenvelhecimento agudo em camundongos que imita de perto as características fisiopatológicas da pele danificada pelo envelhecimento em humanos, mostramos a utilidade da terapia de mRNA COL1A1 baseada em exossomo para substituir a perda dérmica de proteína de colágeno como um tratamento antienvelhecimento para fotoenvelhecimento. pele. Para melhorar a eficiência da entrega e retenção de mRNA, também mostramos que a entrega de mRNA de colágeno através de um adesivo de microagulha de ácido hialurônico (HA) (COL1A1-EV MN) permite uma distribuição mais eficiente de mRNA na derme, resultando em colágeno durável. -enxerto de proteínas e na melhoria do tratamento de rugas na pele fotoenvelhecida.

A atrofia dérmica devido à perda irreversível de colágeno é uma marca registrada do envelhecimento da pele16,17. Numerosos métodos têm como objetivo restaurar a perda de proteína de colágeno na pele, desde abordagens farmacêuticas e de venda livre (antioxidantes18,19,20, retinóides21, peptídeos22,23) até dispositivos médicos (isto é, terapia a laser24 e preenchimentos dérmicos sintéticos25,26) . No entanto, nenhuma dessas tecnologias existentes foi capaz de alcançar a reposição endógena de colágeno a longo prazo para manter a força, firmeza e elasticidade da pele ao longo do tempo27,28,29. A estimulação dos fibroblastos responsáveis ​​pela síntese das proteínas de colágeno também pode ser uma forma eficaz de controle do envelhecimento da pele em curto prazo30. No entanto, os fibroblastos perdem gradualmente a sua capacidade de proliferar e sintetizar colagénio à medida que envelhecem, resultando em desafios para métodos a longo prazo de substituição de colagénio para tratamento anti-envelhecimento31. Para superar essas limitações, nosso objetivo foi substituir a proteína de colágeno em um modelo de fotoenvelhecimento com depleção de colágeno por meio da entrega de mRNA mediada por EV. Para gerar EVs carregados com mRNA de colágeno humano I alfa I (COL1A1), empregamos uma técnica de CNP que envolveu o revestimento de uma monocamada de fibroblastos dérmicos humanos neonatais (nHDFs) em uma superfície de nanoporos e a nanotransfecção das células com um plasmídeo COL1A1-GFP ( Figura 1a e Figura Complementar 1a)14. Os EVs foram isolados dos meios de cultura no dia seguinte à transfecção. Descobriu-se que as células tratadas com CNP têm um número EV 10 vezes maior por célula em comparação com células tratadas com eletroporação em massa padrão (BEP), que foi realizada usando eletrodos paralelos estilo cubeta, como descrito anteriormente, ou nHDFs não tratados em cultura (Fig. .1b). Os EVs produzidos por cada método foram caracterizados por uma distribuição de tamanho com pico de cerca de 150 nm de diâmetro, conforme determinado pela análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e 80% de intensidade no pico do modo por espalhamento dinâmico de luz (DLS) (Fig. 1c e Complementar Figura 1b, c) com índice de polidispersidade (PDI) de 0,12–0,25. Experimentos de Western blot mostraram que as expressões dos biomarcadores exossomo (CD9, CD63, TSG101) e microvesículas (ARF6) no grupo tratado com CNP foram significativamente maiores do que no grupo não tratado, confirmando o aumento nos EVs secretados (Figura 1d suplementar). Análises cinéticas mostraram ainda que a liberação de EV otimizada por voltagem atingiu o pico às 8 h após a indução de CNP, com secreção contínua observada nas 24 h seguintes (Figura 1e, f suplementar). A reação em cadeia da polimerase quantitativa por transcrição reversa (RT-qPCR) mostrou que os EVs secretados por CNP continham mais de 200 vezes o mRNA de COL1A1 do que os EVs secretados por BEP e o mRNA de COL1A1 3.000 vezes maior do que os EVs secretados por células não transfectadas (Fig. 1d ). A avaliação do bioanalisador de gel de agarose demonstrou mRNA de COL1A1 transcrito completo em ~ 4.000 nucleotídeos (Fig. 1e). EVs preparados por CNP exibiram estabilidade estrutural quando armazenados para administração pré-clínica a 4 ° C, sem alterações nas propriedades de aparência, membrana e tamanho quando avaliados por microscopia crioeletrônica (crio-EM), microscopia de força atômica (AFM) e NTA (Fig. Suplementar). .2a–c). Além disso, o ARNm de COL1A1 encapsulado em EVs era estável tanto à temperatura ambiente como a 4 ° C, e também exibia estabilidade sérica, destacando assim o seu potencial para utilidade clínica futura (Figura 2d, e suplementar).